慢病毒包装质粒Mix

使用说明（以10 cm培养皿，为例）：

1．293T细胞分盘：转染前一天，将293T细胞以合适的比例传代到10 cm培养皿中，当细胞长到70%-90%时准备转染。

注：细胞要充分消化，成团细胞影响转染效率。

2．转染前换液：转染前将293T细胞换成新鲜培养基，10 mL/10 cm皿。现在的转染试剂例如Lipofectamine 2000、Lipofectamine 3000、LipoSuper（江苑生物 JY03051）和其他转染试剂，多不受血清和抗生素的影响，此处可换为含有血清和抗生素的完全培养基。具体需根据转染试剂的要求换液。

注：293T细胞贴壁性不是很好，换液时应小心滴加尽量避免冲起细胞。

3．转染：Packaging Mix：表达目的序列的慢病毒载体质粒=1：1

以使用LipoSuper（江苑生物 JY03051）转染试剂为例：

取一只无菌的离心管，加入750 μL DMEM（不含血清和抗生素），10 μg表达目的序列的慢病毒载体质粒（自行提供），和13.5 μL Packaging Mix（10 μg），用枪轻轻吹打混匀；再加入24 μL LipoSuper，用枪轻轻吹打混匀，静置5 min，请特别注意不可Vortex或离心。将混合液均匀滴加到提前换液的细胞培养基中，轻轻晃匀，置于培养箱中培养，后续无需在数小时后更换培养液。

注：上述混合液室温存放6 h内稳定。

某些细胞对转染试剂比较敏感，可以在转染后8-12小时更换细胞培养液，转染效率无显著影响。

以使用Lipofectamine 3000（Invitrogen L3000015）转染试剂为例：

取两只无菌的离心管，一只加入500 μL Opti-MEM和32 μL Lipofectamine 3000，用枪轻轻吹打混匀；另一只加入500 μL Opti-MEM 和10 μg表达目的序列的慢病毒载体质粒（自行提供）、13.5 μL Packaging Mix（10 μg）及40 μL P3000试剂，用枪轻轻吹打混匀。将两管液体混合，再次用枪轻轻吹打混匀，不可Vortex或离心，室温孵育10-15 min。将混合液均匀滴加到提前换液的细胞培养基中，轻轻晃匀，置于培养箱中培养，后续无需在数小时后更换培养液。

注：某些细胞对转染试剂比较敏感，可以在转染后8-12小时更换细胞培养液。

Invitrogen的Protocol显示10 cm培养皿Lipofectamine 3000使用21.7 μL或者43.4 μL两种剂量，自行探索哪个剂量更为合适。本实验室在检测该包装质粒时，选用的剂量为32 μL

4．病毒收集：转染36 h左右后，吸取上清至新的离心管中，4℃保存。另外添加10 mL新鲜的完全培养基到细胞中，注意不要冲起细胞。再次大约36 h后，收取上清至同一个离心管中。将两次收集的上清用0.45 μm滤器过滤后转移到新的离心管中（若没有0.45 μm滤器，将上清3000 rpm，4 ℃离心5 min，弃沉淀亦可）。此时上清液中的病毒颗粒可以直接检测滴度或者感染目的细胞，如果对病毒的滴度及纯度有较高要求，可对上清液进行浓缩与纯化。

注：如果使用滤器过滤，只能使用低蛋白结合力的纤维素醋酸酯或聚醚砜（PES）膜，不能用硝酸纤维素膜（NC）。

5．（可选）慢病毒浓缩：可以使用江苑生物的慢病毒浓缩试剂盒（JY03011）进行慢病毒浓缩，效率更高。同时，也可以自行配制PEG-8000慢病毒浓缩液浓缩慢病毒。

注：慢病毒滴度测定方法参考（江苑生物网站→中心）

6．病毒分装与保存：将病毒上清或浓缩后的病毒分装，保存于-80℃。

注：病毒液一定要分装，切忌反复冻融，冻融一次病毒滴度将降低20-60%。

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